Szybki test molekularny w rozpoznaniu posocznicy

Problem jest niebagatelny. Szacuje się, iż rokrocznie na sepsę zapada ponad 18 milionów ludzi na świecie. W rzeczywistości, biorąc pod uwagę ?ciemną liczbę" nieodnotowanych przypadków, ofiar sepsy może być znacznie więcej. Na domiar złego niejednorodne przyczyny i często niezwykle gwałtowny rozwój posocznicy powodują, iż charakteryzuje się ona bardzo wysoką śmiertelnością, sięgającą 30 proc. w okresie pierwszego miesiąca od momentu rozpoznania i aż 50 proc. po upływie pół roku (NEJM 2001, 345: 1368-77; NEJM 2001, 344: 699-709). Każdego roku w samej tylko Europie z jej powodu umiera ponad 135 tys. osób.
Właściwa diagnoza i podjęcie odpowiedniego indywidualnego toku leczenia wydają się kluczowe w walce z posocznicą. Tymczasem z dostępnych danych wynika, że nawet ponad 10 proc. pacjentów może nie otrzymywać właściwej terapii. Niewłaściwa antybiotykoterapia zmniejsza szansę na przeżycie o 10-15 proc., zaś w przypadkach skrajnych nawet o 90 proc. (Chest 1997, 111: 676-68; Chest 2000, 118: 146-155).
Błędna terapia posocznicy jest niejednokrotnie wynikiem braku bądź niewłaściwej identyfikacji mikroorganizmów stanowiących jej przyczynę. Szybka i niezawodna metoda oznaczania przynależności gatunkowej (lub choćby rodzajowej) drobnoustrojów odpowiedzialnych za rozwój posocznicy może uratować życie niejednego chorego. Tradycyjne metody identyfikacji bakterii i grzybów - głównych winowajców sepsy - bazują najczęściej na czasochłonnych badaniach posiewowych. Oznaczanie bakterii z zastosowaniem tych metod wymaga od 2 do 5 dni, zaś grzybów chorobotwórczych często nawet 8 dni. To bardzo długo w sytuacjach, gdy liczy się każda godzina.
Rozwiązanie problemu czasochłonności testów przynoszą zdobycze współczesnej biologii molekularnej i biotechnologii. Umożliwiają one opracowanie znacznie szybszych technik diagnostycznych, pozwalających wykryć nawet niewielkie ilości DNA patogenu w czasie nieprzekraczającym kilku godzin. Pierwszy taki test o nazwie LightCycler SeptiFast przeznaczony do wykorzystania przy diagnozowaniu przypadków posocznicy opracowany został przez firmę Roche. 12 stycznia 2006 r. uzyskał znak CE (Conformité Européenne) dopuszczający sprzedaż testu na terenie Unii Europejskiej. Test wykorzystuje technologię PCR (tzw. real-time PCR) do amplifikacji oraz związki fluorescencyjne do detekcji zamplifikowanego DNA i pozwala w czasie około 6 godzin na wykrycie w próbce krwi obecności ponad 25 gatunków bakterii i grzybów, które, według danych firmy Roche, w 90 proc. przypadków odpowiedzialne są za wystąpienie posocznicy. Należą do nich: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae/oxytoca, Serratia marcescens, Enterobacter cloacae/aerogenes, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia, Staphylococcus aureus, CNS (Coagulase negative Staphylococci - S. epidermidis, S. haemolyticus), Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus mitis, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis oraz grzyby Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida glabrata, Aspergillus fumigatus.
Test spełnia standardy ?Mgrade", opracowane przez firmę Roche, gwarantujące wysoką czułość metody i odpowiednie procedury chroniące przed kontaminacją analizowanego materiału. Identyfikacja bakterii i grzybów prowadzona jest na podstawie amplifikacji charakterystycznych dla wybranych gatunków regionów ITS (internal transcribed spacer) genomu.
Procedura testowa zawiera 4 etapy. Lizę mikroorganizmów w pobranej 3 ml próbce krwi, ekstrakcje DNA, amplifikację metodą real-time PCR oraz identyfikację z wykorzystaniem specjalistycznego oprogramowania komputerowego. Dodatkowo, opcjonalnie do podstawowego zestawu diagnostycznego, firma Roche oferuje test wykrywający gen mecA (SeptiFast mecA Kit), umożliwiający stwierdzenie ewentualnej oporności na metycylinę w przypadku wykrycia Staphylococcus aureus.
Użyteczności testów dowiodły m.in. dwa, koordynowane przez Roche, wstępne badania wieloośrodkowe z udziałem blisko 600 chorych, prowadzone we Frankfurcie, w Bergamo, Bonn i Kopenhadze. Wykazały one, że test LightCycler SeptiFast pozwalał na jednoczesną identyfikację w próbce krwi 25 gatunków bakterii i grzybów z ponad 99-procentową specyficznością, charakteryzował się ponad 2-3-krotnie wyższą czułością w porównaniu z metodą posiewową w przypadku detekcji bakterii oraz ponad 10-krotną czułością w przypadku detekcji grzybów, a także brakiem interferencji z lekami antybiotykowymi. Wyniki badań zostały zaprezentowane na 16. Europejskim Kongresie Mikrobiologii Klinicznej i Chorób Zakaźnych w Nicei (Francja) 1-4 kwietnia 2006 r. Jak twierdzi Roche Diagnostics, badania kliniczne LightCycler SeptiFast w Polsce będą przeprowadzone w tym roku.
Niezaprzeczalną zaletą testu jest to, iż w krótkim czasie pozwala na wykrycie kilku gatunków drobnoustrojów jednocześnie, co jest niezwykle istotne np. przy mieszanych zakażeniach grzybiczo-bakteryjnych. Niestety, poza opcjonalną możliwością wykrycia szczepów Staphylococcus spp. opornych na metycylinę (MRS), test nie pozwala na bezpośrednie określenie specyficznej lekooporności innych zidentyfikowanych drobnoustrojów. Jednak już sama wczesna znajomość gatunku będącego przyczyną posocznicy znacznie usprawnia procedurę testowania lekooporności oraz zwiększa szansę na dobranie właściwego sposobu leczenia. Jest to szczególnie ważne, gdyż niewłaściwa terapia ma miejsce zwykle w pierwszych dniach po wykryciu sepsy i jest skutkiem braku wystarczających danych mikrobiologicznych (CID 2004; 39: 1161-68).